/ Каталог / Молекулярная диагностика / Электрофорез и блоттинг / Блоттинг
Реагенты для Вестерн-блоттинга
Вестерн-блоттинг — аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков.
Метод применяется в молекулярной биологии, биохимии, генетике и в других естественно-научных дисциплинах.
Преимущества метода:
- высокая чувствительность и специфичность;
- возможность получать полуколичественные и количественные данные об уровнях экспрессии белков путём сравнения интенсивности сигнала с контролями;
Подготовка образца:
Образец для Вестерн-блоттинга может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры.
В большинстве случаев твёрдые ткани сначала измельчаются с помощью гомогенизатора или обработки ультразвуком.
Для улучшения лизиса клеток и растворения белков могут быть применены различные детергенты, соли и буферы.
Для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами часто добавляют ингибиторы протеаз и фосфатаз.
Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.
Для разделения различных клеточных компартментов и органелл применяют комбинации биохимических и механических методик фракционирования, в том числе различные типы фильтрации и центрифугирования.
Процедура метода:
1. Проводят электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по молекулярной массе.
Наиболее распространённый способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли.
2. Белки из геля переносят на мембрану из нитроцеллюлозы, чтобы сделать их доступными для антител и осуществить детекцию.
Перенос на мембрану осуществляется под действием электрического поля (электроблоттинг).
При этом мембрану накладывают на гель, а затем гель с мембраной помещают между слоями плотной бумаги и поролона и погружают в буфер.
3. Мембрану инкубируют с первичными антителами к белку, затем со вторичными антителами, специфичными к первичным антителам и связанными с ферментом (HRP).
4. Образовавшиеся комплексы выявляют с помощью хромогенного субстрата (например, люминола) и визуализируют с помощью имаджера.
Единообразие и общая эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassie blue или Ponceau S.
Краситель Ponceau S обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение меток на мембрану.
Реагенты, необходимые для проведения Вестерн-блоттинга:
- Буферы и реагенты для их приготовления
Трис-глициновый буфер
- Готовые полиакриламидные гели и реагенты для их приготовления
Акриламид
Бисакриламид
TMED
TrisXСl
Персульфат аммония
- Красители для оценки эффективности переноса белков
Понсо S или Кумасси
- Маркеры молекулярной массы и буферы для нанесения
- Мембраны
Нитроцеллюлоза и PVDF
- Хромогенные субстраты
Люминол
- Антитела
Первичные антитела (неконъюгированные или конъюгированные)
Вторичные антитела Информация для заказа
|